X
تبلیغات
کارشناسی کنترل کیفی - دستور العمل آزمایشات میکروبی آب آشامیدنی
تاريخ : سه شنبه هشتم بهمن 1387 | 20:41 | نویسنده : محمد علی

   کلیات  آزمون های کنترل کیفی آب

        آزمایشات موجود در مبحث کنترل کیفیت آب بیشتر بر خصوصیات شاخص های آلودگی مانند اشیریشیا کلی و فلزات سنگبن وکاتیون ها آنیون های ویژه  بنا شده است

       در دوره برگزار شده آزمون ها بیشتر بر پایه میکروبیولوژی استوار بود و در سطح شرکت آب و فاضلاب آزمون های سنجش کلر باقیمانده – کدورت سنجی- ph- دما – رنگ و بوی آب   انجام می پذیرد و سپس طی فعالیتی به نام نمونه برداری  از منبع تامین آب و یا شبکه داخلی  حدود150 سی سی جهت انجام آزمایشات بعدی از قبیل mpn-   و تکمیلی (شناخت نوع کلی فرم) وتشخیصی ارسال می گردد

           انجام آزمایشات میکروبی بر پایه  شاخص های آلودگی آب بویژه کلی فرم ها استوار است و نوع محیطهای کشت منطبق بر نیازهای آنها می باشد ومشاهده کلی فرم ها  وجود آلودگی  انسانی و حیوانی را  تائید می نماید

                محیط های کشت شامل لاکتوز براث بعنوان تشدید کننده  رشدکلی فرم های احتمالی – برلیان گرین بعنوان تائید کننده وجود کلی فرم –و محیط کشت ائوزین متیلن بلو و باکتوپپتون  با معرف کواکس مشخص کننده کلی فرم مدفوعی  می باشد

           لازم به ذکر است کلی فرم ها جزو فلو ر طبیعی روده انسان بوده و مقاوم به املاح صفراوی  وتبدیل کننده لاکتوز به اسید لاکتیک وتولید گاز  co2  در لوله دورهام  را باعث می گردد

         تشخیص باکتری های بیماریزا  مانند حصبه –سالمونلا و شیگلا – وبای التور -  نیاز به محیط کشت مخصوص دارد . همچنین شمارش هتروتروفها نیز تشخیص نیاز شبکه یا منبع ذخیره را به شستشو معین می کند

                                                              (2)

2-1- آب آشاميدني : آب گوارائي است كه عوامل فيزيكي , شيميائي و بيولوژيكي آن در حدي باشد كه مصرف آن عارضه سوئي در كوتاه مدت و يا دراز مدت در انسان ايجاد نكند .

 2-2- دريافت مجاز روزانه : عبارتست از حداكثر مقدار دريافت روزانه يك تركيب براي تمام عمر كه بر مبنأ دانسته‏هاي موجود هيچگونه خطري همراه نخواهد داشت .

 2-3- آفت كشها : اصطلاح آفت كشها شامل حشره كشها , علف هرز كشها , قارچ كشها و موش كشها ميباشد .

  3- نمونه برداري

 3-1- نمونه برداري از آب آشاميدني جهت آزمونهاي روزمره بايد طبق استاندارد شماره 2348 ايران انجام پذيرد .

 3-2- در موارد خاص , نمونه برداري از آب آشاميدني بايد طبق استاندارد شماره 2347 ايران انجام گيرد .

  4- ويژگيها

 4-1- ويژگيهاي باكتريولوژيكي آب : ويژگيهاي باكتريولوژيكي آب آشاميدني در دست تهيه ميباشد .

 يادآوري : با توجه به اينكه در هنگام عبور آب در لوله‏ها امكاناتي جهت آلودگي وجود دارد لذا دو نكته اساسي بايد مورد توجه قرار گيرد  الف : فشار آب درون شبكه لوله كشي بايد در كليه قسمتها بنحوي حفظ گردد كه امكان انتقال , الودگي از خارج بدرون لوله‏ها فراهم نگردد . ب : ميزان كلر باقيمانده بايد در حدي باشد كه آلودگيهاي اتفاقي در شبكه را از بين ببرد در  حال حاضر کلر باقیمانده بین2/ تا 8/ معین گردیده است

                                                 (3)

               

                      نوع و نحوه آزمایشات کنترل کیفی

-      محیط های کشت های میکروبی :

-   تعریف محیط کشت: به مجموعه موادی اتلاق می شود که بتواند غذای لازم وکافی ارگانیزم ها را تا مین نماید محیط های کشت دارای مشخصاتی است که باید به آنها توجه شود .

-      شرایط لازم در محیط های کشت :

-       1-  وجود انواع ومقادیر انواع غذا جهت تامین انرژی وترمیم ورشد میکرو ارگانیزم ها

-       2-  غلظت مواد محلول باید در حدود واندازه ای باشد که برای باکتری زیان آور نبا شد

-       3  - مواد غذایی باکتری ها باید دارای PH مناسب برای رشد باکتری می باشد

-   4- این مواد باید دارای قابلیت استریل شدن و نگهداری آن در محیط مناسب بدون اینکه ارزش غذائی آن از دست برود باشد

محیط های کشت میکروبی که در آزمایشگاه اردستان استفاده می شود:

1- محیط کشت لاکتوز براث LactoseBroth

این محیط به منظور استفاده برای تشخیص کلیفرم ها در آب و فاضلاب بکار برده می شود این محیط از نظر شکل فیزیکی مایع بوده که در لوله های آزمایش تقسیم می شود .

پودر حاضر توسط کارخانه سازنده تهیه شده و به بازار عرضه گردیده است این محیط در دو غلظت   ضعیف وقوی (13گرم درلیتر و 26 گرم در لیتر)تهیه و مورد استفاده قرار می گیرد  پس از تهیه محیط کشت در غلظت های یاد شده آن رادر لوله های آزمایش بزرگ دورهام دار به مقدار 10 میلی لیتر(قوی)و در لوله های متوسط بقدار 10 میلی لیتر (ضعیف) تقسیم می نمایند و پس از مسدود نمودن درب لوله هاباپنبه ودر پوش آلومینیومی آنها را در ظرف مناسب( سبد سیمی) قرار داده و در اتوکلاو در درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد بمدت 15 دقیقه آنهارا استریل نموده پس از سرد شدن در یخچال نگهداری می شود لوله ها ئیکه به این منظور تهیه شده اند باید طوری انتخاب شوند که پس از ریختن محیط کشت درون آنه بمقدار لازم بیش از نصف لوله را اشغال ننماید

                                                                    (4)

                                                     

 

 

2- محیط کشت برلیان گرین بیل براث Brilliant green bile broth 2%

این محیط کشت نیز جهت آزمایش تائیدی آب و فاضلاب استفاده می شود رنگ این محیط سبز است و به آن محیط کشت سبز درخشان نیز می گویند این پودر توسط کارخانه های سازنده تهی گردیده و در بازار موجود است برای تهیه محیط آماده مقدار 40 گرم پودحاضر را در یک لیتر آب مقطر حل کرده ودر لوله های متوسط دورهام دار بمقدار 10 میلی لیتر پس از پنبه گذاری وغلاف آلومینیومی در حرارت 121 درجه سانتی گراد بمدت 15 دقیقه آن را استریل نموده و در یخچال نگهداری می کنیم این محیط بصورت مایع باشد

3-محیط کشت E.M.B (Eosin Methylen Blue Agar)

این محیط جهت کشت اختصاصی کلیفرمها مناسب است محیطی  جامد به رنگ بنفش و کلنی های E-coli روی این محیط به رنگ سبز مایل به بنفش یا جلای فلزی ظاهر می شود که به وضوح قابل رویت است پودر آماده توسط کارخانه های سازنده تهیه شده و به بازار ارائه گردیده است طبق دستور کارخانه سازنده مقدار لازم از پودر مزبور رادر یک لیتر آب مقطر ریخته آن را بخوبی مخلوط نموده سپس آن را حرارت داده تا آگار آن بخوبی حل شود .

آن را در اتوکلاو بمدت 15 دقیقه و حرارت 121 درجه سانتی گراد استریل کرده پس از سرد شدن تا حدود 45 درجه سانتی گراد بقدار 25 میلی لیتر در پلیت های استریل شده تقسیم نموده پس از خنک شدن  و منعقد شدن محیط آن را به صورت وارونه در یخچال نگهداری نمائید از این محیط جهت کشت خطی و تشخیص ای کلی و کلبسیلا استفاده می شود

4- محیط کشت آردوآ آگارR2A.Agar

این محیط کشت برای روشspread plate وpour plate  استفاده می شود. این محیط کشت با مواد مغذی کم شمارش کلنی بیشتری را نسبت به محیط کشت با مواد مغذی زیاد نشان می دهد .

Ph را با محلول k2hpo4یا kh2po4 جامد قبل از اضافه کردن آگار در حد 2/7 تنظیم می کنند. برای حل شدن آگار محیط کشت را حرارت داده و در 121 درجه ی سلسیوس به مدت 15 دقیقه سترون می کنیم                                   

                                                                          (5)                                                       

                                                                   

روش های انجام آزمایشات کنترل کیفی

شمارش احتمالی کلیفرم ها-M.P.N(most probable number)

اندیس m.p.n با استفاده از روش چند لوله ای : گروه کلیفرمها باکتریهای هوازی و بیهوازی اختیاری- گرم منفی- بدون اسپور و میله ای شکل هستند که قادرند لاکتوز را در فاصله 48 ساعت در حرارت 5/+ - 35 درجه سانتی گراد تخمیر نموده و ایجاد گاز نمایند. آزمایش کلی فرم ها را به دو روش لوله های تخمیری شامل آزمایش های احتمالی – تائیدی-  تکمیلی انجام داد و یا با روش ممبران فیلتر که در این صورت کلی باکتری های هوازی و بیهوازی اختیاری گرم منفی بدون اسپور – میله ای شکل که قادرند کلنی های تیره رنگ در فاصله 24 ساعت روی محیط کشت Endo Agarکه لاکتوز اضافه شده تولید نماید.

                                         آزمایش استاندارد M.P.N

1-   تست احتمالی Persumptive.test

محیط کشت مورد استفاده لاکتوز براث می باشدکه پودر حاضر بصورت تجارتی در بازار وجود دارد آن را برابر دستورالعمل کارخانه سازنده تهیه نموده در لوله های آزمایش تقسیم کرده و در هر لوله یک لوله دورهام بصورت وارونه داخل آن قرار می دهیم و آن را استریل کرده و در یخچال نگهداری می کنند.

روش آزمایش:  انجام آزمایش با روش 9 لوله ای می باشد.

ابتدا سه لوله از محیط های کشت لاکتوز براث قوی( 26/gr/lit) که حاوی 10 میلی لیتر محیط کشت لاکتوزبراث در سمت چپ جا لوله آزمایش قرار می گیرد پس از آن شش لوله دیگر از محیط کشت لاکتوز براث ضعیف (13/gr/lit) هر لوله محتوی 10 میلی لیتر محیط کشت در کنار آنها قرار دارده و از نمونه مورد آزمایش که به صورت استریل تهیه شده و آن را به خوبی مخلوط نموده ایم و به صورت یکنواخت در آمده است با پیپت استریل به ترتیب از چپ به راست در هر یک از سه لوله اول 10 میلی لیتر نمونه اضافه کرده و به هر یک از سه لوله بعدی یک میلی لیتر و به هر یک از سه لوله آخر 1/0 میلی لیتر نمونه مورد آزمایش اضافه کرده کلیه این عملیات باید در شرایط استریل و با دقت انجام شود که از آلودگی های ثانوی مبرا باشد. لوله ها کمی به آرامی حرکت داده تا نمونه و محیط مخلوط شود در لوله های دورهام نباید هیچگونه گاز یا حبابی از هوا وجود داشته باشد سپس آن را در اتو 5/0+ - 35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار می دهیم

                                                           (6)

     در صورتیکه در تمام لوله های دورهام گاز تولید شده باشد آن را مثبت تلقی کرده  و اگر تعدادی یا همه آنها فاقد گاز بودند آن را برای مدت 24 ساعت دیگر در اتو باقی می گذاریم پس از انقضا مدت مجدداٌ لوله ها را بازدید کرده و موارد مثبت یا منفی را یادداشت می نمایند  وجود گاز پس از 48 ساعت دلیل بر مثبت بودن آزمایش است و اگر در هیچیک گازی مشاهده نشد آزمایش احتمالی منفی است در مورد تخمین تعداد کلیفرم در صورت مثبت بودن برای 100 میلی لیتر نمونه آب به جدول مربوطه مراجعه نموده و تعداد احتمالی کلیفرم را تعیین می نمائیم باید توجه داشت زمانی آزمایش مثبت از اطمینان بیشتر برخوردار است که در اکثر لوله ها گاز تولید شده باشد.

نحوه گزارش: پس از استخراج عدد m.p.n  از جدول مراتب عیناٌ گزارش می گردد. بطور مثال اندیسp.n .m در نمونه مثلاٌ   A برابر است با 11 که معنی و مفهوم آن این است که محتمل ترین تعداد در 100 میلی متر نمونه 11 باکتری می باشد. چنانچه جدول در اختیار نداشته باشیم و یا شمارش مثبت ها با جدول مطابقت نکند (در جدول نگنجد) می توان از این رابطه مقدار M.P.N را محاسبه نمود:

تعداد لوله های مثبت ضربدر 100 تقسیم بر رادیکال ضرب مجموع میلی لیتر نمونه در لوله های منفی و مجموع میلی لیتر نمونه در تمامی لوله ها

    2- روش آزمایش تاییدی : در این روش از محیط کشت Brelliantgreen BileBroth    استفاده می شود این محیط را نیز طبق دستور کارخانه سازنده در لوله های آزمایش حاوی دورهام و محیط کشت مزبور که قبلاٌ تهیه و استریل گردیده استفاده می شود . انجام آزمایش تاییدی منوط به مثبت بودن آزمایش M.P.N  است که در مقابل هر لوله مثبت لاکتوز براث حاوی گاز در لوله دورهام آن یک لوله برلیان گرین در مقابل آن قرار داده و در شرایط استریل و با دقت یک تا دو قطره از محیط لاکتوز براث مثبت به محیط کشت برلیان گرین بیل براث اضافه نموده آن را در دمای 5/0 +-35 به مدت 48 ساعت در انکو باتور قرار داده در صورت ایجاد گاز در لوله های دور هام محیط کشت برلیان گرین آزمایش مثبت تلقی شده یعنی مراحل قبلی تا یید می گردد .

     3-  آزمایش تکمیلی   completed   test

این آزمایش نیز پس از مثبت بودن آزمایش تاییدی انجام می گیرد  

   روش آزمایش : از کلیه لوله های مثبت در آزمایش تاییدی به صورت روش خطی بر روی

                                                            (7)

 محیط کشت E.M.Bکشت داده می شود پس از انجام کشت آن را برای مدت 2+ - 24 ساعت در اتو 5/0 + - 35 درجه سانتی گراد قرار داده کلو نی های رشد کرده روی این محیط شکل های  1-مشخص 2- غیر مشخص 3 - منفی تقسیم می شود

1- کلنی های مشخص  Typical  به صورت هسته دار و جلای فلزی یا بدون جلای فلزی می باشد

2-   کلنی های غیر مشخص بدون هسته با رنگ مات که بعد از 24 ساعت صورتی رنگ می شوند  

3-  سایر کلنی های موجود منفی تلقی می شود در بیان نتایج لا مشاهده کلنی های هسته دار با جلای فلزی گزارش اشیرشیا کلی ودیدن کلنی های صورتی رنگ روی این محیط کلبیسلا گزارش می شود برای اطمینان بیشتر  از هر جعبه پتری محتوی کشت یک یا چند کلنی مشخص انتخاب کرده در یک لوله محتوی محیط لاکتوز براث حاوی لوله دورهام کشت داده و قسمتی نیز روی محیط کشت Natural Agar   پس از مدت 24 تا 48 ساعت در اتو 35 درجه سانتی گراد لوله های حاوی لاکتوز براث دارای گاز در لوله دورهام مثبت تلقی می شود واگر از محیط کشت نوترین آگار فروتی تهیه شود وآن را با رنگ گرم رنگ آمیزی نمائید وجود باسیل های گرم منفی بدون اسپور  دلیل بر وجود کلی فرم ها می باشد در این صورت آزمایش تکمیلی مثبت است.

اعلام  نتیجه آزمون میکروبی :

در آزمایشگاه  میکروبی آب و فاضلاب روستائی اردستان کلیفرم گرماپای با واحدml100 / MPN  احتمالی  و تاییدی بیشتر از 2/2  و نوع میکروب E.coli   یا kellebsilla  گزارش می شود و در صورت عدم  تولید گاز و بون تغییر ماندن رنگ در مرحله احتمالی یا احتمالی عدم وجود کلی فرم ها گزارش می شود

همچنین در اعلام نتایج آزمون میکروبی تعداد جمعیت میکروبی (HPC) با واحد (cfu/ml  ) گزارش می گردد. که در صفحه بعد نوع محیط کشت و روش اجرائی بیان می گردد                          

                                                               (8)        

آزمایش HPC (شمارش میکرو ارگانیسم های هترو تروف)

شمارش میکرو ارگانیسم ها ی هتروتروف که پیش از این تحت عنوان شمارش پلیت استاندارد شناخته می شد – روشی است که توسط آن تعداد باکتری های  هتروتروف زنده در آب اندازه گیری شده و جزء تغییرات کیفی به هنگام تصفیه و توزیع آب و یا کیفیت آب استخرهای شنا بررسی می گردد . کلنی های مورد مطالعه با این روش می توانند به صورت دوتایی – زنجیره ای- خوشه ای و یا منفرد تشکیل شوندکه همه انواع آن تحت عنوان واحد های تشکیل دهنده کلنی (CFU ) نامیده می شوند .شمارش نهایی به مقدار موثر انتشار کلنی بستگی دارد از این رو روش کار و محیط کشت به گونه ای باید انتخاب شود که بتواند بیشترین تعداد کلنی را در مدت معینی از گرماگذاری تولید کند در حال حاض سه روش و 4 محیط کشت وجود دارد که بیان می گردد:

روش های 1- پور پلیت 2- کشت سطحی یا اسپرید پلیت 3- صافی غشایی یا ممبران فیلتر

محیط های کشت : Plate count agar-1 2-m HPC Agar   3-R2A Agar 4- NWRI Agar(HPCA)

روش پورپلیت : مقدار1/0 تا 1 میلی لیتر از نمونه یا نمونه ای رقیق شده که به وسیله ی پیپت به پلیت سترون اضافه و سپس محیط کشت آگار مذاب را می افزاییم و پس از مخلوط شدن باید سرد و منجمدگردد سپس گرماگذاری شده و شمارش کلنی انجام می گردد.

روش کشت سطحی : مقدار 1/0 یا 5/0 میلی لیتر از نمونه یا 1/0 یا 5/0 میلی لیتر از رقت مناسب نمونه به محیط کشت حاوی آگار جامد شده موجود در پلیت اضافه می شود . نمونه ی تلقیح شده  بر روی سطح محیط کشت را با یک میله شیشه ای سترون به صورت یکنواخت پخش می گردد.در این روش همه کلنی ها بر روی سطح محیط کشت به وجود آمده و مانع از نفوذ کلنی ها به داخل آگار مذاب می شود . پس از گرماگذاری در دما زمان مناسب – کلنی های باکتری ها را بر روی سطح آگار شمارش می نمایند

روش صافی غشایی : این روش در مورد نمونه های آب با حجم زیاد و کدورت کم و معمولاٌ برای آب هایی با احتمال شمارش کلنی (کمتر از Cfu/ml 10- 1) به کار می رود این روش شوک گرمائی ایجاد نمی کند و هزینه های آن برای تهیه صافی های غشایی بیشتر از دو روش  دیگر برشمرده می شود

                                                          (9)

روش کشت سطحی (Spread Plate):

1- پلیت ها را به ترتیب چیده و علامت گذاری می نمائیم .پلیت شاهد – دو سری پلیت برای هر نمونه مورد آزمایش و نمونه کنترل مثبت برای یک سری از نمونه ها تهیه می کنیم. برای کنترل شرایط سترون از 1/0 میلی لیتر آب رقیق سازی سترون استفاده می گردد.این کار برای اطمینان از سترون بودن پیپت – آگار ورقیق سازی انجام می گیرد

2-   نمونه ها را رقیق سازی می نمائیم

3-    براساس نمونه ها و رقت ها پلیت ها را مرتب می نمائیم

4- نمونه هاو رقت ها را قبل از اینکه با استفاده از پیپت به داخل پلیت منتقل کنیم بایستی به شدت تکان داد

5-  در حالی که پلیت را می چرخانید نمونه یا حجم رقیق شده (1/0 یا5/0 میلی لیتر رابا استفاده از پیپت روی سطح محیط آگار جامد می ر یزیم

6-  نمونه تلقیح شده را روی سطح محیط کشت با استفاده از میله شیشه ای سترون به طور یکنواخت پخش کنید این کار با ثابت نگه داشتن میله شیشه ای بر روی سطح آگار و حرکت دادن پلیت و یا با حرکت دادن میله شیشه ای بر روی سطح محیط کشت انجام می شود در این روش همه کلنی ها بر روی سطح محیط کشت شکل می گیرند

7-   قبل از گرماگذاری اجازه می دهیم تا نمونه تلقیح شده بطور کامل در محیط کشت جذب شود

8-  وقتی سطح محیط کشت آگار خشک شد درب پلیت ها را بسته آنها را بطور وارونه برای انجام آزمایش های اختصاصی به مدت 48 ساعت در  حرارت 35 درجه سلسیوس قرار می دهیم پس از گرماگذاری در دما و مدت زمان مناسب کلنی های مجزا بر روی سطح محیط کشت پدیدار می شوند

محاسبه و گزارش نتیجه ی آزمایش:

برای محاسبه ی شمارش پلیت – کل کلنی های شمارش شده و یا میانگین آن ها(در موردپلیت های دوتائی از یک ضریب رقت یکسان ) در هر پلیت در عکس ضریب رقت ضرب می شود. بهتر است ابتدا تا دو رقم معنی دار (دو رقم سمت چپ ) گرد شده سپس بصورت Cfu/ml گزارش شود

                                                    (10)  

 



  • تالار نیوز
  • شیر شاه